Poco antes del mediodía del 26 de noviembre de 1504, en el Palacio Real de Medina del Campo, fallecía la reina Isabel I de Castilla. Se ponía fin así a casi tres décadas de reinado de una de las mayores soberanas que ha visto España. El 12 de octubre del mes anterior a su muerte, enferma y consciente de su grave estado, Isabel elaboró su testamento. La Católica procuró dejar todo atado y bien atado, para que todo lo logrado durante su vida no se perdiera a su muerte.

A esta empresa la reina dedicó todos sus esfuerzos durante sus últimos días. Consciente de la fragilidad de su hija Juana 'La Loca' y desconfiando del marido de esta, Felipe 'El Hermoso', decidió que su esposo Fernando administrara y gobernara Castilla hasta que su nieto Carlos, el futuro Carlos I de España, cumpliera los veinte años. Fernando cumplió con la ley y proclamó a Juana Reina de Castilla, pero fue el quien tomó las riendas de la gobernación del reino acogiéndose a la última voluntad de la reina Isabel.

El marido de Juana, el archiduque Felipe, no estaba dispuesto a renunciar al trono de Castilla y perder el poder que tanto buscó, consiguiendo que en la concordia de Salamanca (1505) se acordara el gobierno conjunto de Felipe, Fernando el Católico y la propia Juana.

Pero Castilla y en especial la nobleza castellana, recelosa de un regente aragonés y apoyada por un Felipe recién llegado a España, no apoyaron a Fernando, que optó por retirarse a Aragón cumpliendo así la concordia de Villafáfila (1506). Felipe fue proclamado rey de Castilla en las Cortes de Valladolid con el nombre de Felipe I.

El reinado de Felipe I y Juana de Castilla se vio truncado ese mismo año por el repentino fallecimiento del recién nombrado soberano. Tan súbita fue su muerte que corrió el rumor de que su suegro lo había envenenado. Según parece, murió por beber agua demasiado fría después de hacer ejercicio.

Este acontecimiento hizo explotar a Juana en un delirio paranoide que la llevó a desenterrar el cadáver de su marido ya embalsamado e iniciar una fúnebre procesión por el Reino de Castilla en la que viajó únicamente de noche, pues decía que "una mujer honesta, después de haber perdido a su marido, que es su sol, debe huir de la luz del día", según los relatos de sus cortesanos.

A la muerte de Felipe, el cardenal Cisneros asumió su primera regencia del Reino de Castilla, esperando la llegada del rey Fernando. Fernando el Católico aprovechó la situación para asumir el control del trono y encerrar a Juana en el monasterio de Tordesillas, donde permaneció hasta su muerte en 1555.

Finalmente, Fernando gobernó Castilla hasta su muerte en 1516. Le sucedió Carlos, hijo de Juana y nieto de Isabel y Fernando. Carlos se encontraría con una herencia grandiosa: los reinos de sus cuatro abuelos, que lo convertirían en uno de los más importantes monarcas que han existido bajo el nombre de Carlos I de España y V del Sacro Imperio Romano Germánico.

En su testamento, la reina Isabel estipuló que, si bien la heredera del trono era su hija Juana, su esposo el rey Fernando administraría y gobernaría Castilla en su nombre al menos hasta que el infante Carlos, primogénito de Juana, cumpliera veinte años. Además, Isabel pidió a sus sucesores que se esforzasen en conquistar para el cristianismo el Norte de África continuando la reconquista peninsular y que se convirtiese al cristianismo a los habitantes de América y se les tratase justamente.